產品(pin)規格（CAT#: DE1001）
DH5α Electroporation-Competent Cell 50μl/支
pUC19 (control vector，10pg/μl): 10μl
保(bao)存條件(保(bao)質期)： -80℃（6個月）
基(ji)因型(xing)
F- φ80 lac ZΔM15 Δ(lacZYA-arg F) U169 endA1 recA1 hsdR17(rk-,mk+) supE44λ- thi -1 gyrA96 relA1 phoA
產品說(shuo)明
DH5α電擊感受態細胞只能用于電擊轉化，不能用于熱激轉化。DH5α菌株是實驗室最常用的感受態細胞。 缺失核酸內切酶 (endA)，提高了質粒DNA的產量和質量；重組酶缺陷型 (recA)減少插入片段的同源重組概率，保證了插入DNA 的穩定性；lacZΔM15的存在使DH5α可用于藍、白斑篩選。DH5α電擊感受態細胞經特殊工藝制作，pUC19質粒檢測轉化效率可達1×1010 cfu/μg DNA。
操作方法(fa)
1. 0.1cm 電擊杯和杯蓋從儲存液中拿出(chu)倒置于干凈的吸水紙上(shang)5分鐘，待其瀝干水分，正置5分(fen)鐘，使乙醇(chun)充分(fen)揮發，待乙醇(chun)揮發干(gan)凈(jing)立即插(cha)入冰(bing)中，壓實冰(bing)面，電極杯頂(ding)離冰(bing)面0.5 cm以方便蓋上杯蓋，冰中靜置5分(fen)(fen)鐘充分(fen)(fen)降(jiang)溫。
2. ;取-80℃保存的(de)DH5α電擊(ji)感受態細胞插(cha)入冰中(zhong)5 分鐘，待其融化，加入目的(de)DNA (質粒或連接產(chan)物(wu))并用手撥打EP管底輕輕混勻，避(bi)免(mian)產(chan)生氣泡，立即(ji)插(cha)入冰中(zhong)。
A. 測定(ding)轉化效率使用1 μl 10 pg/μl的對照質粒 pUC19；
B. 對于連接產物，請用乙醇沉淀DNA后加入適量TE緩沖液 (10mM Tris HCl, pH7.5; 1mM EDTA)重懸，DNA濃度不超過100ng/μl，體積不超過5μl/50μl 感受態。
3. 用200 μl槍頭將感(gan)受態-DNA混合物快(kuai)速(su)移到電擊杯中，避(bi)免產生氣泡，蓋上杯蓋。
4. 啟動電轉儀，設(she)置參(can)數(shu)：C=25 μF，PC=200 Ω，V=1.8 kV (此為BioRad 電轉儀推薦(jian)參(can)數(shu)，也可(ke)按(an)所用電轉儀推薦(jian)的(de)參(can)數(shu)操作），將電擊(ji)杯快速放入電轉槽中(zhong)，電擊(ji)完成快速插入冰(bing)中(zhong)。
5. 2分鐘后從冰中(zhong)取出電(dian)擊杯，放室溫，加入700 μl不(bu)含抗(kang)生素的(de)無菌S.O.C. 培養基（室溫），用1ml槍吹吸(xi)電(dian)擊杯底部數次混勻后，轉(zhuan)移到50ml離心管（BD Falcon50ml錐形離心管等），向離心管中(zhong)補加S.O.C. 培養基至5ml。37℃，225 rpm復(fu)蘇60分鐘。
6. 5000rpm離心一分鐘(zhong)收菌，重懸后取100-200 μl涂布到含相應抗生素的(de)S.O.C平(ping)板上（因菌量較大(da)，若全(quan)部涂板請選用直徑15cm培(pei)(pei)養皿2-5個）。將平(ping)板倒置放于37℃培(pei)(pei)養箱(xiang)過夜培(pei)(pei)養13-17小時(shi)。
S.O.C 培養基配方
2% Tryptone
0.5% Yeast Extract
10 mM NaCl
2.5 mM KCl
10 mM MgCl2
10 mM MgSO4
20 mM glucose
PH-7.0
S.O.C. Medium is suitable for use in the final step of cell transformation to obtain maximal transformation efficiency of E. coli (Hanahan, 1983).
注意事(shi)項
1. 加(jia)入DNA時體積不應大(da)于感受態體積的(de)1/10。
2. 電(dian)擊感受(shou)態細胞(bao)加(jia)入電(dian)擊杯應避(bi)免產生氣泡(pao)，氣泡(pao)會增加(jia)弧(hu)光放電(dian)風險。
3. 當(dang)DNA不(bu)純或存(cun)在鹽，乙醇，蛋(dan)白及緩沖(chong)液等污(wu)染時(shi)，轉化效率急劇下(xia)降。
4. 電(dian)擊(ji)杯里的離子可增(zeng)加溶液的電(dian)導(dao)，增(zeng)大在含有細胞和DNA的溶液中產生電(dian)流和弧光放電(dian)的風險。
5. 若轉化(hua)大質(zhi)粒或想獲得較高轉化(hua)效率，推薦使用高純質(zhi)粒提取(qu)(qu)試(shi)劑盒(he)提取(qu)(qu)質(zhi)粒。質(zhi)粒增大一倍，轉化(hua)效率下(xia)降(jiang)一個數量級。
6. 對于連接產物轉化(hua)，最好轉化(hua)前乙醇沉淀(dian)DNA后用適量TE緩沖(chong)液(ye) (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重懸(xuan)產物，保(bao)證DNA濃度(du)不超過100 ng/μl。過(guo)高濃(nong)度連(lian)接產物(wu)或過(guo)大體積連(lian)接產物(wu)會降(jiang)低轉化效率，增加(jia)弧光放電的風險。
7. 混入(ru)質(zhi)粒時(shi)應輕(qing)柔操作，吸取感受態細胞時(shi)不(bu)可(ke)用孔徑過(guo)小的槍(qiang)頭 (普(pu)通200ul槍(qiang)頭應剪去槍(qiang)頭尖0.6cm) 避免(mian)用力過(guo)猛(meng)，以免(mian)剪切力過(guo)大損傷細胞膜，降低轉化效率。轉化高濃度的質(zhi)粒或連接產物可(ke)相應減少(shao)最終(zhong)用于(yu)涂板的菌(jun)量。
8. 電擊感受態細胞最好保存在-80℃以下，高于-80℃超期儲存會(hui)(hui)導致轉化效率會(hui)(hui)下降。
