TOP10 Electroporation-Competent Cell 產品說明書
產品規格(ge)（CAT#: DE1010）
TOP10 Electroporation-Competent Cell 50μl/支
pUC19 (control vector，10pg/μl): 10μl
保(bao)存條(tiao)件(保(bao)質期)： -80℃（6個月）
基因型
F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80 lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 araΔ139 Δ(ara-leu)7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG
產(chan)品說(shuo)明
TOP10電(dian)擊(ji)感受態細(xi)胞只(zhi)能(neng)用(yong)(yong)于電(dian)擊(ji)轉(zhuan)化，不能(neng)用(yong)(yong)于熱激轉(zhuan)化。TOP10來源(yuan)于MC1061菌株，是目前(qian)實驗室最常用(yong)(yong)的感受態細(xi)胞之(zhi)一，基因型與DH10B高度類似(si) (DH10B為galE15型，而TOP10為galU型(xing))。TOP10生長速度(du)快(kuai) (比DH5α快(kuai)，但比Mach1-T1生長速度(du)慢)，10小時可見克隆。recA1和endA1的突變有利于(yu)插入(ru)DNA的穩定(ding)和高純度質粒DNA的提取。可用(yong)于(yu)構建克隆(long)，藍白斑篩選等實(shi)驗。TOP10電擊感受態(tai)細胞(bao)經特殊(shu)工藝制作(zuo)，pUC19質粒檢測轉化效率可達(da)1×1010 cfu/μg DNA。
操作(zuo)方(fang)法
1. 0.1 cm 電擊杯和杯蓋從儲(chu)存液(ye)中拿出倒置于(yu)干(gan)凈的吸水(shui)紙上5分鐘，待其瀝(li)干(gan)水(shui)分，正(zheng)置5分鐘，使乙
醇充分揮發，待乙醇揮發干(gan)凈立即插入冰(bing)中，壓實(shi)冰(bing)面(mian)，電極杯頂離冰(bing)面(mian)0.5 cm以方便蓋(gai)上杯蓋(gai)，冰(bing)中
靜(jing)置5分鐘充分降溫。
2. 取-80℃保存的(de)TOP10電擊感(gan)受態細胞(bao)插入冰中5 分鐘，待其融(rong)化，加入目的(de)DNA (質粒或連接產(chan)物)
并用(yong)手撥打(da)EP管底輕輕混勻，避免產生氣泡(pao)，立即插入冰中(zhong)。
A. 測定轉化效率使(shi)用(yong)1 μl 10 pg/μl的對(dui)照質粒(li) pUC19；
B. 對于連接產(chan)物，請(qing)用乙(yi)醇沉(chen)淀DNA后加(jia)入適量(liang)TE緩沖液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重
懸，DNA濃度不超過100 ng/μl，體積不超過5 μl/50 μl感受(shou)態。
3. 用(yong)200 μl槍(qiang)頭(用(yong)刀切除0.5cm槍(qiang)尖)將(jiang)感受態-DNA混(hun)合物快速移到(dao)電擊杯中，避免(mian)產生氣(qi)泡，蓋上杯蓋。
4. 啟動電轉儀，設置參(can)數：C=25 μF，PC=200 Ω，V=1.8 kV (此為(wei)BioRad 電轉儀推(tui)薦參(can)數，也可按(an)所用(yong)
電(dian)轉(zhuan)儀推薦的參數操作），將電(dian)擊(ji)(ji)杯(bei)快速放入(ru)(ru)電(dian)轉(zhuan)槽中，電(dian)擊(ji)(ji)完成(cheng)快速插入(ru)(ru)冰(bing)中。
5. 2分鐘后從冰中取出電擊杯，放室(shi)溫，加入1ml不含抗生素(su)的無菌(jun)S.O.C. 培養基（室(shi)溫），用1ml
槍吹吸電擊(ji)杯底部數次混勻(yun)后，轉移到50 ml離心(xin)管(guan)（BD Falcon 50 ml錐形離心(xin)管(guan)等），向離心(xin)管(guan)中
補加S.O.C. 培養(yang)基至10 ml。傾斜45度放入搖床，37℃，225 rpm復蘇(su)60分鐘。
6. 5000 rpm離心一分鐘收菌(jun)，重(zhong)懸后取100-200 μl涂布到含相應抗生(sheng)素(su)的(de)S.O.C平板上（因菌(jun)量(liang)較大，
若全(quan)部涂板請選用(yong)直徑15cm培養(yang)(yang)皿2-5個）。將平板倒置放于(yu)37℃培養(yang)(yang)箱過(guo)夜培養(yang)(yang)13-17小(xiao)時。
S.O.C 培養基配方
2% Tryptone
0.5% Yeast Extract
10 mM NaCl
2.5 mM KCl
10 mM MgCl2
10 mM MgSO4
20 mM glucose
PH-7.0
S.O.C. Medium is suitable for use in the final step of cell transformation to obtain
maximal transformation efficiency of E. coli (Hanahan, 1983).
注意事項
1. 加入DNA時(shi)體(ti)積不應大于感受態體(ti)積的1/10。
2. 電(dian)擊(ji)感受態(tai)細胞加入(ru)電(dian)擊(ji)杯應避免產生氣(qi)泡，氣(qi)泡會增加弧光放電(dian)風險。
3. 當DNA不純或存(cun)在(zai)鹽，乙醇(chun)，蛋白及緩沖液等污染時，轉(zhuan)化(hua)效率急劇下(xia)降。
4. 電擊(ji)杯里的(de)(de)離(li)子可增加溶(rong)液的(de)(de)電導，增大在含有細胞和(he)DNA的(de)(de)溶(rong)液中(zhong)產生電流(liu)和(he)弧光放電的(de)(de)風險。
5. 若轉(zhuan)化大(da)質(zhi)粒(li)或想獲(huo)得較高轉(zhuan)化效率(lv)，推薦使用高純質(zhi)粒(li)提(ti)取試劑(ji)盒提(ti)取質(zhi)粒(li)。質(zhi)粒(li)增大(da)一倍，轉(zhuan)化效率(lv)下降一個數量(liang)級。
6. 對(dui)于連(lian)(lian)接產物轉(zhuan)化，最(zui)好轉(zhuan)化前乙醇沉淀(dian)DNA后用(yong)適量TE緩(huan)沖液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重懸產物，保證DNA濃度不超過100 ng/μl。過高濃度連(lian)(lian)接產物或(huo)過大(da)體(ti)積連(lian)(lian)接產物會降低轉(zhuan)化效率(lv)，增(zeng)加弧(hu)光放電的風險。
7. 混入質粒(li)時應輕(qing)柔操作，吸取(qu)感受態細胞時避免用力過猛，以免剪切力過大損傷細胞膜，降(jiang)低(di)轉(zhuan)(zhuan)化(hua)效率。轉(zhuan)(zhuan)化(hua)高濃度的質粒(li)或連接產物(wu)可(ke)相(xiang)應減(jian)少(shao)最(zui)終用于涂板的菌量。
8. 電擊感受態細胞最好(hao)保存在-80℃以(yi)下，高于-80℃超期儲存會導致轉(zhuan)化效率會下降。
