一、實(shi)驗簡(jian)介(jie)

線粒體膜電位的下(xia)降是細(xi)胞凋亡早(zao)期(qi)的一個標志性事件。JC-1是一種理想的(de)用于檢測(ce)線(xian)(xian)粒體膜電(dian)位(wei)的(de)熒(ying)光探針，可以檢測(ce)細胞、組織或純(chun)化的(de)線(xian)(xian)粒體膜電(dian)位(wei)。其(qi)原理是，當線(xian)(xian)粒體膜電(dian)位(wei)較高時，JC-1聚(ju)(ju)集在線粒體(ti)基質中(zhong)，形成聚(ju)(ju)合物(wu)，488nm激發(fa)時的***發(fa)射波長(chang)為590nm，可以產生紅色熒光，在流式上表現為FL1和FL2雙陽(yang)性；當線粒體膜(mo)電位(wei)較(jiao)低時，JC-1不能(neng)聚集在線粒體基質(zhi)中，此時JC-1為單體，488nm激發時***發射波長為527nm，可以(yi)產(chan)生綠色熒光，形成(cheng)流式圖(tu)匯(hui)總所有細(xi)胞FL1為陽性。凋亡(wang)細胞則大多為FL1單(dan)陽(yang)性。不同(tong)熒光顏色的(de)轉變(bian)反(fan)應線(xian)粒(li)體膜電(dian)位(wei)的(de)變(bian)化，常用紅(hong)綠(lv)熒光的(de)相對(dui)比例衡量線(xian)粒(li)體去(qu)極化的(de)比例。

二、流式(shi)JC-1實驗步驟(zou)

1、收集細(xi)胞：細胞(bao)懸液轉入離心管中，1000rpm離心5min收集(ji)細胞(bao),棄上清。

2、PBS洗滌細胞：加入(ru)3ml 4℃預(yu)冷(leng)的PBS完(wan)全重懸細胞(bao)，1000rpm離心5min，棄上清。沉淀震(zhen)蕩(dang)混勻(yun)。

3、細胞(bao)計(ji)數：移取10微升(sheng)在血(xue)細胞(bao)計(ji)數儀(yi)上(shang)進行(xing)細胞(bao)計(ji)數 ,調整細胞為(wei)0.5-1×10^6/ml。

4、裝載探針：按照1:500用(yong)無血清培養基稀釋JC-1，使終濃度(du)為10ug/mL。

5、孵(fu)育探針：37°C細胞(bao)培(pei)養箱內(nei)孵育(yu)20分(fen)鐘，每隔3-5分鐘顛倒(dao)混勻(yun)一(yi)下，使探(tan)針(zhen)(zhen)和細(xi)胞充(chong)分接觸，用(yong)無血(xue)清的(de)培養液洗滌(di)細(xi)胞三次，以去除未進入細(xi)胞內的(de)探(tan)針(zhen)(zhen)。

6、上機檢測：流式細胞(bao)儀使用(yong)激發波(bo)長Ex=488 nm，發射波(bo)長FL1(Em=525±20 nm)；FL2(Em=585±20 nm)，用(yong)Flow Jo軟件分析結果。