一、實驗(yan)簡介
細胞(bao)轉染是(shi)指將外(wai)源分子如DNA、RNA等(deng)導(dao)入真(zhen)核細(xi)(xi)胞的(de)技(ji)術。主要包括：電穿孔法(fa)、顯微注射、基因槍、磷酸鈣共沉淀法(fa)、脂質(zhi)(zhi)體轉(zhuan)(zhuan)染(ran)法(fa)、病毒介(jie)導(dao)的(de)轉(zhuan)(zhuan)染(ran)等(deng)，理想的(de)轉(zhuan)(zhuan)染(ran)方法(fa)是具有高(gao)轉(zhuan)(zhuan)染(ran)效率、對細(xi)(xi)胞毒性作用(yong)小等(deng)。其中脂質(zhi)(zhi)體轉(zhuan)(zhuan)染(ran)是常用(yong)的(de)簡便轉(zhuan)(zhuan)染(ran)方法(fa)。
脂質體(ti)（liposome）轉染方法的原理在于，陽(yang)離(li)子(zi)脂質體(ti)表面(mian)帶正電荷，能與(yu)核酸的(de)磷酸根通過靜電(dian)作(zuo)用將DNA分(fen)子包裹，形(xing)成DNA-脂復(fu)合體，被表面帶負(fu)電荷(he)的細胞(bao)膜吸附。再通過膜的融合或細胞(bao)的內吞(tun)作(zuo)用，偶爾(er)通過直接滲(shen)透作(zuo)用，將DNA轉運至細胞內，形成包(bao)涵體或進入溶酶(mei)體。當DNA從包涵(han)體(ti)內釋放后(hou)，進入(ru)細胞質(zhi)，再進一步(bu)進入核內(nei)實現轉錄、表達。
細(xi)胞感染(ran)是指通過(guo)病毒載體將外源分子導入真核細(xi)胞。因(yin)(yin)病(bing)毒(du)可以(yi)通過自身的(de)(de)(de)(de)侵襲作用(yong)(yong)進入(ru)(ru)宿主(zhu)細(xi)胞(bao)后(hou)，可以(yi)利用(yong)(yong)細(xi)胞(bao)中的(de)(de)(de)(de)物質和能量以(yi)及(ji)復制(zhi)、轉(zhuan)錄(lu)和轉(zhuan)譯的(de)(de)(de)(de)能力，按照自身核(he)酸所包含的(de)(de)(de)(de)遺(yi)傳信(xin)息產生和它一樣的(de)(de)(de)(de)新一代(dai)病(bing)毒(du)。利用(yong)(yong)這種特性，去(qu)掉病(bing)毒(du)的(de)(de)(de)(de)致(zhi)毒(du)基(ji)(ji)因(yin)(yin)并(bing)將外源基(ji)(ji)因(yin)(yin)片(pian)段(duan)插入(ru)(ru)制(zhi)成病(bing)毒(du)載體(ti)，進而將目的(de)(de)(de)(de)片(pian)段(duan)轉(zhuan)入(ru)(ru)受體(ti)細(xi)胞(bao)，使目的(de)(de)(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin)可以(yi)表達，甚至(zhi)將基(ji)(ji)因(yin)(yin)遺(yi)傳給后(hou)代(dai)穩定的(de)(de)(de)(de)表達。目前常見用(yong)(yong)于轉(zhuan)染的(de)(de)(de)(de)病(bing)毒(du)有，慢病(bing)毒(du)，逆轉(zhuan)錄(lu)病(bing)毒(du)，腺病(bing)毒(du)等。
二、siRNA/shRNA/miRNA/DNA轉染(ran)細胞實驗步驟(zou)（以6孔板為例(li)）
1 轉染前一天接種細(xi)胞于6孔板，5×104每孔，第二天轉(zhuan)染(ran)時細胞匯合度達到60%-70%每(mei)孔(kong)。
2 轉染(ran)前半(ban)小時(shi)將完全培(pei)養基換無血清培(pei)養基1.9 ml。
3 A液：RNA 100 pmol/DNA 2μg （根據核酸類型不同，用量不同）加入50 ul Opti-MEM無血清培養基，輕輕混(hun)勻，室(shi)溫靜(jing)置5min。
4 B液：脂(zhi)質(zhi)體使用前輕輕混勻，脂(zhi)質(zhi)體5ul 加入50 ul Opti-MEM無血(xue)清培養基，輕輕混(hun)勻，室溫靜置5min。
5 B液加入到(dao)A液中，用槍輕輕混勻，室(shi)溫靜(jing)止20min。
6 將混(hun)合液均勻分(fen)散慢慢滴加到6孔板細胞(bao)中，邊滴加邊前后左右十字交(jiao)叉輕(qing)輕(qing)搖晃。
7 孵箱37℃培養4~6h，然(ran)后(hou)將無血清培養基換成(cheng)完全培養基繼續培養。
8 mRNA 水平的檢測：在(zai)轉染后(hou)24-48h后，用Real-time PCR的方法在mRNA水平進行檢測。
9 蛋白(bai)水平的檢(jian)測：在(zai)轉(zhuan)染后(hou)48-72h后(hou)，用Western-blot或免疫組(zu)化的方法在蛋白水平進(jin)行檢測。
三、細胞感(gan)染實驗步驟（以慢(man)病毒感(gan)染為(wei)例(li)）
1、轉(zhuan)染(ran)前一(yi)天(tian)，取2-3×105cells/well的細胞接種在6孔板(ban)上，培養24h后將原(yuan)有培養基棄(qi)去，加入2mL的細(xi)胞完全培養基。
2、置于CO2濃度為5%的培養箱中于37℃培(pei)養至細(xi)胞匯合達到40-60%。
3、細胞(bao)換液，將病(bing)毒液與終(zhong)濃度5μg/ml polybrene加入新鮮培養基中。8-12h后(hou)觀察細胞(bao)(bao)狀(zhuang)態(tai)，若細胞(bao)(bao)狀(zhuang)態(tai)無明顯病變，繼續培養(yang)，24h后更換新鮮培養基。
4、根(gen)據公式計算病毒用量 （細胞(bao)數×MOI值(zhi)/病毒原(yuan)液滴度(du)）×103=病毒(du)用量（μl）
5、72-96h察熒光表達情況(kuang)，對生長代謝緩慢(man)的細胞，可適當延長觀察時(shi)間，并及時(shi)換液和傳代維持細胞生長狀態(tai)。
注意(yi)：感染細胞***MOI的(de)測定：MOI（感染復數(shu)）是(shi)指每個(ge)細胞感染的病毒數(shu)。通(tong)常MOI高，病毒整(zheng)合到染(ran)色體(ti)的(de)(de)數量(liang)以及目(mu)的(de)(de)蛋白的(de)(de)表達(da)量(liang)越高。對于分(fen)裂活躍(yue)的(de)(de)細胞(bao)，例(li)如HeLa、293細(xi)胞，MOI=1-3時(shi)，80%以(yi)上細(xi)胞(bao)均表(biao)達(da)目的基因。而(er)對于非(fei)活躍的細(xi)胞(bao)，如原代細(xi)胞(bao)，感(gan)染效(xiao)率較低，需(xu)要進(jin)行MOI濃度摸(mo)索實驗，選擇合適的MOI后(hou)再進行后(hou)續實驗。
