1 實驗(yan)簡介

Fluo-3廣泛用于長(chang)波長(chang)的熒光鈣指示劑。其在506 nm處被(bei)(bei)吸收，可(ke)以被(bei)(bei)氬離子激光的488 nm激發光激發，便(bian)于檢測(ce)。Fluo-3在沒有同鈣結合(he)的情(qing)況下，無熒(ying)光(guang)產(chan)生。但(dan)是，在與鈣結合(he)后，熒(ying)光(guang)（526 nm）增強至少40倍。Fluo-3/AM是一種可以穿透細胞膜的(de)熒光染料。Fluo-3/AM的熒(ying)光非常(chang)弱(ruo)，其熒(ying)光不會隨(sui)鈣離子濃度升高而增強。Fluo-3/AM進入細胞后(hou)可以被細胞內的酯酶剪切形成Fluo-3，從(cong)而被滯留(liu)在細胞內。Fluo-3可以(yi)和鈣離子(zi)(zi)結合，結合鈣離子(zi)(zi)后可以(yi)產生較強的熒光(guang)，***激發(fa)波長為506 nm，***發射波長為526 nm。實際檢測時(shi)推薦使用的激發波長為488 nm左右(you)，發射波長為525-530 nm。

2 實驗步驟

1.用(yong)激光共聚焦專用(yong)培(pei)養皿培(pei)養細(xi)胞。去除培(pei)養基后，用(yong)PBS洗(xi)滌細胞，然(ran)后加入(ru)適量(liang)含有fluo-3/AM的(de)PBS緩沖液（fluo-3/AM終濃(nong)度為0.5-5 μM），置(zhi)于37℃避光孵育 30分(fen)鐘。探針濃度和負載時間需(xu)要根據細胞類(lei)型進行調整，可(ke)查閱文獻。

2.用PBS溶液輕洗2次(ci)，再加(jia)入PBS緩沖液，繼續孵育20 min，37℃，確保(bao)fluo-3/AM在胞內完全水解成fluo-3。

3.用LCSM采集(ji)熒光信號，激發波長488 nm，發射波長525 nm。

注意： 此處理方法(fa)適(shi)用于貼壁細胞。如(ru)果是(shi)懸浮細胞或半懸浮細胞，可低(di)速(su)離心收集細(xi)胞后，進行處理，然后(hou)取細胞(bao)懸液滴在共聚焦(jiao)專(zhuan)用蓋(gai)玻(bo)片(pian)上直接觀(guan)察。