CCK-8檢測（Cell Counting kit-8）
CCK-8細胞(bao)毒性(xing)試驗檢(jian)測為(wei)MTT法(fa)的(de)(de)替代(dai)方法(fa)，是一種基(ji)于(yu)WST（2-（2-甲氧(yang)基(ji)-4-硝(xiao)苯基(ji)）-5-（2,4-二磺基(ji)苯）-2H-四氮單鈉鹽），廣(guang)泛應用于(yu)細胞(bao)毒性(xing)的(de)(de)檢(jian)測。
CCK-8（Cell Counting kit-8）試(shi)劑中含(han)有(you)WST–8：化學(xue)名：2-(2-甲(jia)(jia)氧(yang)基-4-硝基苯(ben)基)-3-(4-硝基苯(ben)基)-5-(2,4-二(er)磺酸(suan)(suan)苯(ben))-2H-四唑(zuo)單鈉(na)鹽，它(ta)在(zai)電(dian)子載體(ti)1-甲(jia)(jia)氧(yang)基-5-甲(jia)(jia)基吩嗪硫酸(suan)(suan)二(er)甲(jia)(jia)酯（1-Methoxy PMS）的(de)作(zuo)用下被(bei)細胞(bao)線粒體(ti)中的(de)脫氫(qing)酶還原(yuan)為具有(you)高度水(shui)溶(rong)性的(de)黃(huang)色甲(jia)(jia)臜產(chan)物(wu)（Formazan），生成(cheng)的(de)甲(jia)(jia)臜物(wu)的(de)數(shu)(shu)量(liang)與活細胞(bao)的(de)數(shu)(shu)量(liang)成(cheng)正比(bi)，可采(cai)用酶聯(lian)免(mian)疫檢(jian)測儀在(zai)450nm波長處測定其光吸收值，間(jian)接反映活細胞(bao)數(shu)(shu)量(liang)。
技術應用
該(gai)方法已被廣泛用于大規(gui)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xi)胞(bao)增值實(shi)驗（1-6天）、細(xi)胞(bao)毒性實(shi)驗、藥物敏感度實(shi)驗、細(xi)胞(bao)基質黏(nian)附實(shi)驗等(deng)。
實驗流程：
（1）客戶提供細(xi)胞株（凍存(cun)株或(huo)培養細(xi)胞）及處理用的藥物
（2）進行(xing)加(jia)藥處理及(ji)孵育時間
（3）檢測吸光度值
（4）進(jin)行數據分析及(ji)圖片
優點：
（1）MTT被線粒體內的一些脫氫還原酶還原成的formazan不是水溶性的，需要有特定的溶解液來溶解,而CCK-8產生的formazan都是水溶性的,可以省去后續的溶解步驟;
（2）CCK-8檢測靈敏度更高,更加穩定;
（3）酚紅和血清對其測定無明顯影響;
（4）不必去上清,不必洗,滌細胞,更加簡便;
（5）對(dui)細胞無明(ming)顯毒性,加(jia)入顯色后(hou),可以(yi)在不同時間反復用酶標儀讀板,使檢(jian)測(ce)時間更加(jia)靈活,而且不影響(xiang)細胞進行后(hou)續實驗。
在加藥(yao)實驗過程中(zhong)對CCK-8測定的影響：
（1）注意如果藥物(wu)具有還(huan)原性,會(hui)和CCK-8發生(sheng)顯色反應(ying),增加(jia)吸光(guang)度。
（2）藥物中的金(jin)屬對CCK-8顯色(se)有影(ying)響:當終濃度(du)為(wei)1mM的氯化亞鉛(qian)、氧(yang)化鐵、硫(liu)酸銅會抑制5%,15%, 90%的顯色(se)反應,使(shi)靈(ling)敏度(du)降級。如果終濃度(du)是10mM的話，將會100%抑制。
解決辦法(fa)
首先要(yao)確認藥(yao)物(wu)是否有吸(xi)收,在(zai)含(han)有藥(yao)物(wu)的培養(yang)基(ji)中加(jia)入(ru)CCK-8,測定450nm的吸(xi)光度(du),如果它(ta)的吸(xi)光度(du)比不(bu)含(han)藥(yao)物(wu)的培養(yang)基(ji)(加(jia)CCK-8)的吸(xi)光度(du)高,則證明藥(yao)物(wu)有影響,可在(zai)加(jia)CCK-8之前(qian)更(geng)換(huan)培養(yang)基(ji),去掉藥(yao)物(wu)的影響。
（3）由于培養基(ji)中可能(neng)含有(you)氧化還原反應的物質,在正式實驗之(zhi)前,建議使用一個孔作(zuo)一下檢測,有(you)必(bi)要先確認培養基(ji)和(he)CCK-8是否反應。一般正常的0D值應該(gai)在0.4以(yi)下。
空白對(dui)照
在不含細胞的(de)(de)培養(yang)基(ji)中(zhong)加入(ru)(ru)CCK-8,培養(yang)一(yi)定(ding)的(de)(de)時(shi)間,測定(ding)450nm的(de)(de)吸光(guang)度(du)即為(wei)空白對照。在做加藥實(shi)驗(細胞毒性實(shi)驗)時(shi),還(huan)應(ying)考慮藥物的(de)(de)吸收,可在不含細胞,加入(ru)(ru)藥物的(de)(de)培養(yang)基(ji)中(zhong)加入(ru)(ru)CCK-8,培養(yang)一(yi)定(ding)的(de)(de)時(shi)間,測定(ding)450nm的(de)(de)吸光(guang)度(du)作為(wei)空白對照。
靈敏(min)度影響
（1）對于不同的(de)細胞，靈敏度不一樣，懸(xuan)浮細胞較(jiao)貼壁細胞難染色(se)。
（2）對于貼壁細胞,一(yi)般加入CCK-8培養1-4小時吸光度已經很高，但對于懸浮細胞則(ze)可能吸光度較低，可以通過(guo)延長CCK-8的加入時間或增(zeng)加細胞數量來解(jie)決(jue)。
細胞(bao)黏附性
（1）以層粘連蛋(dan)白(Ln)包被96孔板,通過(guo)計算不同時間(jian)點孔板中貼壁細(xi)(xi)胞(bao)的數(shu)量(liang)反映細(xi)(xi)胞(bao)的黏(nian)附性。
（2）細(xi)胞(bao)(bao)的(de)黏(nian)附性越強,則單位(wei)時(shi)間內貼于(yu)鋪(pu)有Ln板底的(de)細(xi)胞(bao)(bao)數量(liang)越多，去除尚未貼壁的(de)細(xi)胞(bao)(bao)后，應用CCK-8等方(fang)法計量(liang)細(xi)胞(bao)(bao)數量(liang)便可間接反映不同細(xi)胞(bao)(bao)或不同處理(li)的(de)細(xi)胞(bao)(bao)黏(nian)附能力(li)的(de)差異(yi)。
藥(yao)物濃度檢(jian)測(ce)
將細(xi)胞培養后(hou)按照不同濃度(du)(du)的藥物處理-定時(shi)間后(hou)進行CCK-8檢(jian)測(ce)，根(gen)據吸(xi)光度(du)(du)繪制(zhi)曲線(xian),計算該藥物抑制(zhi)細(xi)胞數量一半時(shi)的濃度(du)(du)(IC50)。
